Tecnología del DNA recombinado

Traducción hecha en la Universidad de Alcalá de Henares, España

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Problemas sobre tecnología del DNA recombinado

Tutoría para el problema 5: DNA recombinado, 3.ª parte

¿Cuál de las siguientes operaciones NO es parte de los procesos normales en la clonación de DNA recombinado en bacterias?

A. Digestión de los DNA celulares y plasmídicos con una endonucleasa de restricción.

B. Producción de DNA recombinado usando DNA ligasa y una mezcla de DNA celulares y plasmídicos digeridos.

C. Separación de los DNAs recombinados por electroforesis y uso de la técnica de Southern para determinar dónde migra el recombinante deseado.

D. Transformación de bacterias con los plásmidos recombinados y selección usando ampicilina.

E. Análisis de clones bacterianos con sondas de DNA radiactivo y complementario al gen elegido.

Tutoría

Generación de DNA recombinado

Se digiere un vector plásmido con EcoRI en un solo punto, produciendo dos extremos cohesivos.

Se digiere también una muestra de DNA humano con EcoRI para producir fragmentos con los mismos extremos cohesivos.

Se puede usar DNA humano o bien un cDNA copiado desde un mRNA usando la transcriptasa inversa de un retrovirus.

Las dos muestras de DNA se mezclan para que puedan hibridar; se formarán algunas moléculas con fragmentos de DNA humano insertado dentro del vector plásmido en el sitio EcoRI.

Se usa la DNA ligasa para unir covalentemente los fragmentos.

Transformación: incorporación del plásmido recombinado a las bacterias

Selección de las células transgénicas resistentes al antibiótico

El plásmido vector contiene un gen de resistencia a ampicilina, lo que hace a la célula resistente.

El crecimiento de las células transformadas (células que han recibido el plásmido) se puede identificar sobre un medio de agar que contenga el antibiótico (por ej., ampicilina).

La mutagénesis insercional permite identificar los plásmidos con inserto de DNA

Identificación de clones

El plásmido vector contiene otro gen identificable (por ej., para resistencia a una segunda droga o para una actividad enzimática), cuya secuencia codificante contiene el lugar de restricción para la inserción.

La inserción del DNA ajeno en ese lugar interrumpe el marco de lectura del gen, generando una mutagénesis insercional.

En el ejemplo mostrado, se inactiva el gen de la ß-galactosidasa. El sustrato "X-gal" se convierte en un producto de color azul si el gen está intacto, es decir, si se produce la enzima activa. Las colonias blancas en el ensayo X-gal indican la presencia de DNA recombinado en el plásmido.

Búsqueda de clones que contengan el gen apropiado

En el siguiente esquema, las bacterias que contienen plásmidos recombinados crecen formando clones. Éstos se transfieren a una membrana, el DNA que contienen se desnaturaliza y se fija sobre la superficie. Se añade una sonda radiactiva (un fragmento de DNA complementario) y se permite que tenga lugar su hibridación con el DNA; se expone a una película sensible a rayos X y así se identifican los clones que contengan DNA recombinado con el inserto correcto.

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El Proyecto Biológico
University of Arizona
November 1996
Traducido: junio 2005
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